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[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT緩沖液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應(yīng)加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內(nèi)，或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。3．用l根牙簽輕輕接觸單個克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動，注意不要轉(zhuǎn)移太...
[器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設(shè)備●已擴增的scFv基因文庫DNA[方法]1．配制4個50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...
[器材和試劑]●去離子水（millipore）●T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文庫DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●電感受態(tài)大腸桿菌TGl細胞（Strataeene）●用于將scFv文庫電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl株的試劑和設(shè)備[方法]1．配制1個50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...
1．多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。2．根據(jù)廠家說明，對抗原進行生物素化。3．選擇前，在1個1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個1．5m1微量離心管，室溫1小時；而后，棄去封閉緩沖液。以3個不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進行孵育，室溫振蕩l小時。對于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為K...
選擇3～5輪后，隨機挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導表達可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細菌上清。此過程可以識別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴謹性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號強度不能很好地顯示哪個克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術(shù)，能識別出具有較低Ka值的克隆。競爭性或抑制性...
A液（80ml）：1％氯化金，lml；雙重蒸餾水，79ml。B液（20m1）：1％檸檬酸鈉，4ml；1％單寧酸，0.lml；雙重蒸餾水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；將上述A液加熱到60℃，然后將B液快速加入到A液中，繼續(xù)攪拌，在極短的時間內(nèi)加熱到煮沸（大約10min），此時顏色由黑一藍一亮紅（近似紅葡萄酒顏色）變化。pH調(diào)到所需要求（根據(jù)所標記蛋白質(zhì)種類的不同，所需的pH也不一樣）。上述用量合成的膠體金為10nm，根據(jù)所加入鞣酸（或稱單寧酸）量的不同...
乙醇—超聲波還原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml雙重蒸餾水。（2）用0．2m01/LK2C03調(diào)pH至7．2，再加入lml無水乙醇。（3）用20KC、135W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進行超聲振蕩，此法制備的顆粒為6～10nm。硼氫化鈉還原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml預(yù)冷（4℃）雙蒸餾水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）邊攪拌邊加入新鮮配制...
『安全』是進行任何實驗zui重要的考量，若不留意，經(jīng)常會造成*的遺憾，因此，請遵守以下各項規(guī)定：1.請事先勘查緊急沖洗站、洗眼臺及滅火器的位置。2.請避免穿著涼鞋或拖鞋（腳趾不要裸露），并請穿著實驗衣。留長發(fā)者，在實驗進行前將頭發(fā)束好。3.在實驗室請勿吸煙、化妝、嚼口香糖、吃東西、喝飲料。食物不可存放于實驗室的冰箱中。4.實驗前后請將工作區(qū)域清理擦拭干凈，實驗中打翻任何藥品試劑時，要隨時清理；離開實驗室前請記得洗手。5.使用刻度吸管時，切勿用嘴吸取，請用安全吸球或吸管唧筒。6...
當前位置：
