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[方法]1．配制1個(gè)50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的scFv文庫(kù)（100g/ul）,7ul●T4DNA連接酶（400U／ul），2ul2．16℃孵育反應(yīng)液過(guò)夜。3．乙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗滌沉淀1次。4．重懸DNA于10ul水中。5．用4份相同的2．5ul的DNA分別電轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞中。6．確定文庫(kù)容量，并將菌文庫(kù)材抖儲(chǔ)存于-70...
[方法]1．每個(gè)克隆用lml2XTY／amp／S1u30~C培養(yǎng)過(guò)夜，250r／min振蕩。2．取50u1過(guò)夜培養(yǎng)物，加入到含有5ml2XTY／amp／0．1％glu的50ml試管內(nèi)；并在30℃培養(yǎng)大約2小時(shí)，250r／Illin振蕩，吸光度（A600）大約0．9。3．每管加入2．5ullmol／LIPTG誘導(dǎo)scFv表達(dá)（終濃度為500umol／L），并在30℃培養(yǎng)4h，250r／min振蕩。在1個(gè)15mlFalcon試管內(nèi)4000g離心15分鐘，收集細(xì)胞。4．準(zhǔn)備外周質(zhì)提...
免疫組織化學(xué)（1HC）或稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)是一種方法學(xué)，根據(jù)特異性抗原—抗體反應(yīng)的原理，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原或抗體成分。IHC有一個(gè)很長(zhǎng)的發(fā)展歷史，已有半個(gè)世紀(jì)以上，自Coons創(chuàng)建免疫熒光組化技術(shù)以來(lái)，不斷有人（或公司）推出更為敏感的方法，經(jīng)過(guò)60多年的不斷努力和發(fā)展，由zui初的免疫熒光直接標(biāo)記法，逐步出現(xiàn)了間接法、免疫酶法、親和細(xì)胞化學(xué)方法、免疫膠體金法，多聚物酶法（或稱(chēng)非生物素放大法）、CSA法、原位免疫PCR法及循環(huán)放大法等。目前提高免疫組化敏感性可通過(guò)如下幾種途徑來(lái)...
①膠體金溶液可以重復(fù)制備，其顆粒大小可以控制，可較容易進(jìn)行免疫電鏡的雙重或多重標(biāo)記；②金標(biāo)探針有很高的電子密度，有特殊的分辨率，定位準(zhǔn)確；③金標(biāo)探針能發(fā)射二次電子和反射電子，是掃描電鏡目前的標(biāo)記物；④金標(biāo)探針與組織細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合后，可用銀增強(qiáng)，大大提高了IHC的敏感性，是目前zui為敏感的IHC方法之一；⑤免疫金銀染色方法無(wú)致癌性，使用較安全。膠體金技術(shù)是以膠體金作為一種標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它具有一般溶膠的特性。溶膠是指一種物質(zhì)以或大或小的微小粒子分散在另一種物質(zhì)...
（一）膠體金的顏色溶膠的顏色取決于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的分散度和入射光線的種類(lèi)，是散射光線還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長(zhǎng)越短。對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō)，粒子大小不同，呈現(xiàn)的顏色亦不同。如膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈紅色的葡萄酒色；20～40nm之間的金溶膠主要吸收波長(zhǎng)530nm的綠色光，溶液呈深紅色；60nm的膠體金溶膠主要吸收波長(zhǎng)600nm的橙黃色光，溶液呈藍(lán)紫色。一般應(yīng)用于免疫組織化學(xué)的膠體金顆粒為5～60nm范圍內(nèi)，溶液...
[方法]1．建立以下連接反應(yīng)：●載體DNA（pG6AppG6B，pG6C）（10ug）xul●cDNA片段（3～5ug）yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul●水400ul2．在16℃過(guò)夜孵育。3．在70℃孵育30分鐘，使T4DNA連接酶變性。4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的微離心管中。5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心...
[方法]1．加2～3ul純化的連接反應(yīng)物（zui大值為0.3ugDNA）到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。2．將細(xì)胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0．2cm細(xì)胞電轉(zhuǎn)化管，并冰浴3分鐘。3，將GenePulserPlus電穿孔儀設(shè)置為2．5kV脈沖，電容器設(shè)為25uF，脈沖控制器設(shè)為200ns。4．用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管，然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中，使用一個(gè)脈沖（寄存時(shí)間常量必須為4．5～5．0毫秒）。5．立即加lml...
[方法]1．將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上，并在37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)（180r/min）。2．使用96孔復(fù)制板將其接種到裝有200ulLBAT的第二塊96孔培養(yǎng)板上，在37℃培養(yǎng)直到生長(zhǎng)中期（大約1，5小時(shí)）。3．在每一孔中加入10ul2×1011TU/mlR408輔助噬菌體。4．37℃無(wú)振蕩培養(yǎng)30分鐘。5．37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。6．4℃800g離心20分鐘，收集細(xì)胞。7．將上清液轉(zhuǎn)移到一新的96孔培養(yǎng)板上，并加40pulPEG/NaCl。8．將板放置于冰上1小...
當(dāng)前位置：
