1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標準濃度。但有時需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。
2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。
3．加入200gl的2％MPBS封閉每個板孔，37℃孵育2小時。
4．用PBS洗滌板孔3次。
5．每孔加入50ul的4％MPBS。
6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復吹吸混勻，室溫孵育1小時。
7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次。
8．每孔加入100ul 9E10單抗（用2％MPBS按1：1000稀釋）。室溫孵育孔板l小時。
9．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次。
10．每孔加入抗小鼠HRP（用2％MPBS按1：2000稀釋）。室溫孵育孔板1小時。
11．棄去二抗，并用PBS／Tween和PBS分別洗滌3次。
12．每孔加入100ul TMB系統(tǒng)溶液，并在暗處室溫孵育10～30分鐘。數分鐘內，應呈現藍色。
13．每孔加入50～100ul終止液，終止反應。
14．在450nm處讀板。

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