麥芽糖結(jié)合蛋白ELISA的方法與以前論文所述一致[1Sj，除了從大腸桿菌中釋放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我們發(fā)現(xiàn)，使用商業(yè)性的去垢劑（Pierce公司的B-PER抽提試劑）較溶菌酶能更簡單有效地裂解細(xì)菌細(xì)胞。3 ml培養(yǎng)基中的經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞先通過沉降，再通過含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重懸。于室溫下放置20分鐘后，離心5分鐘以除去細(xì)胞碎片，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的管中。裂解物于一70~0凍存，當(dāng)用于ELISA反應(yīng)時按1：50稀釋。

在幾個實驗項目中，我們發(fā)現(xiàn)麥芽糖結(jié)合蛋白ELISA反應(yīng)中的強(qiáng)信號經(jīng)常能夠代表肽段與所研究的受體的高親和性。當(dāng)然，對于嚴(yán)格的分析肽段的性質(zhì)而言，zui終的化學(xué)合成肽段是必要的。如果是大規(guī)模的篩選克隆，先采用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行克隆黏附分析，可以為后面的ELISA分析提供更少的克隆集合。

我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)高親和力的肽配體的過程中，使用噬菌體載體展示和乳糖抑制物/冠狀二聚體展示存在著很大的共性。通常，通過兩種方法篩選得到的是相似家族的肽段。在某些情況下，我們發(fā)現(xiàn)其中的某種方法對于某個特定受體的初始特異性肽的搜尋或從一個序列家族中篩選zui高親和力的變異體要較優(yōu)于另一種方法。這可能與所展示肽段的定向不同或者與兩種方法的生物約束因素不同有關(guān)。然而，無論是使用哪種系統(tǒng)，zui有效的篩選高親和力配體方法是先分離出至少一個能與靶標(biāo)結(jié)合的序列家族，然后通過增加嚴(yán)謹(jǐn)性，篩選含有從先導(dǎo)肽衍生出的大量變異體的次的庫。通過這種多步的方法，就可以有效地探索到單個大庫無法展示的序列空白。

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